免RNA提取RT-PCR试剂盒

免RNA提取RT-PCR试剂盒

英文名称：Cell Lysate RT-PCR Kit

运输：低温

保存：负20℃

有效期：1年

货期：1-2天

其他： 

产品介绍：

无需DNA提取，直接扩增

产品及特点

本产品是一种免 RNA 提取的 RT-PCR 试剂盒，它使用精心优化的细胞裂解液直接裂解培养细胞，然后直接在细胞裂解液中进行 RT，再用 cDNA 进行 PCR或荧光定量 PCR。本产品特点如下：

1. 免 RNA 提取，从细胞裂解到 RT-PCR 或实时定量 RT-PCR 结果只需三个步骤，省略了整个 RNA 提取过程。

2. 灵敏度不低于常规方法（先提总 RNA 再进行 RT-PCR），不但可以检测到低拷贝的 RNA，还可用于检测 miRNA。

3. 整合了去除基因组 DNA 的步骤，只检测 RNA，无需担心基因组 DNA 的污染。

4. 每次只需要 10-100000 个培养细胞或含相应细胞数的痕量组织（如 LCM样品），验证过的细胞包括 Hela、CHO、293、COS-7 等，但不能用于U937 细胞系。

5. 两步法 RT-PCR，后续使用灵活。得到的 cDNA 既可用于普通 PCR，也可用于基于 SYBR 的荧光定量 PCR，也可用于其他定量 PCR（如 TaqMan），非常灵活。

6. 即适用于少量样品，也适用于平行处理大量样品及高通量筛查。

7. 本产品足够用于 50 次 20µL 体系的 RT 和 600 次 30µL 体系（或约 200 次100µL 体系）的 PCR。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期两年。

自备试剂 RT 引物、PCR 引物对

使用方法

注意：无 RNase 的环境和使用无 RNase 污染的试剂是本实验成功的关键。 强烈建议使用的固相 RNase 清除剂去除工作台面的 RNase，用气相 RNase 去除空气中的 RNase。实验前需要将 95%乙醇放-70℃预冷，最好用空 枪头盒盛乙醇。

一、细胞培养、裂解

1. 按常规方法培养细胞、胰酶消化并计数。

2. 转移 1×10E5 个细胞到离心管中，400×g 离心 4 分钟。

3. 吸弃上清（即培养基），保留细胞沉淀。

4. 用 0.5 mL 溶液 A 重悬细胞，并将细胞浓度调整到 2×10E5 细胞/mL。

5. 转移 10 µL 的悬浮细胞到 0.2 mL PCR 管中，并加入 10 µL 的溶液 B，此 时细胞终浓度为 10E5 细胞/mL。

6. 迅速将离心管插入浮子中，放入-70℃预冷的、95%乙醇中 1-3 分钟。10 µL 枪头盒一般能让 0.2 mL 的 PCR 管一半没入到乙醇中。

7. 在室温的水浴锅中快速解冻细胞，涡旋 10 秒后短暂离心数秒，将管中液体 （细胞裂解液）转移到新的离心管中，放冰上待用。

二、RT（逆转录）反应合成 cDNA

8. 按下表设置 RT 反应体系（以 20 µL 体系为例）:

成分 样品管 阴性对照管 细胞裂解液（含 RNA） 2.5 µL 2.5 µL RT Buffer（含 dNTP） 6 µL 6 µL MMLV 逆转录酶（含 RI） 2 µL 无 RT 引物(100ng/µL) 1 µL 1 µL RNase-free 水 补水到 20 µL 补水到 20 µL

9. 42℃保温 60 分钟。此步为 RT 反应。

10. 70℃保温 10 分钟以终止反应，然后放冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作 为 PCR 模板使用，不需要纯化。也可以放置在-20℃长期保存。 三、PCR 方案一（RT 产物全部用于 PCR）

11.在上步的 RT 反应管中直接按下表加入各成分（以 100 µL 体系为例）： 成分 每管加入量 PCR MagicMix 3.0（已加染料） 50 µL 自备正向 PCR 引物 (100 ng/µL) 2 µL RNase-free 水 补水到 100 µL

12.直接进入第 14 步。

四、PCR 方案二（部分 RT 产物用于 PCR）

13.按下表设置 PCR 反应体系（以 30 µL 体系为例）：

成分 每管加入量

PCR MagicMix 3.0（已加染料） 15 µL

cDNA 样品（RT 反应产物） 1-5 µL

自备正向 PCR 引物 (100 ng/µL) 1 µL

自备反向 PCR 引物 (100 ng/µL) 1 µL

RNase-free 水 补水到 30 µL

注意：RT 引物可以用做反向 PCR 引物。

14. PCR 反应参数(需要根据模板和引物 Tm 值决定，下面的参数只做参考)：

过程 温度 时间

预变性 94℃ 5 min

PCR 反应

（35 个循环）

94℃ 1 min

55℃ 1 min

72℃ 2 min

最后延伸 72℃ 10 min

四、电泳检测

15.取 5-10 µL PCR 产物直接在琼脂糖凝胶上电泳，跟分子量标准比较估计出扩增产物的大小。注：本试剂盒中的 PCR mix 含有甘油和染料，可以直接上样，不需要额外再加电泳上样液。