高pH缓冲液套装

高pH缓冲液套装

英文名称： One-Stop Protein Native PAGE Pack 

运输：常温

保存：常温

有效期：1年

货期：1-2天

其他：

产品介绍：

非变性蛋白电泳高pH缓冲液

产品及特点

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)是目前电泳法分离活性蛋白的主要方法之一，跟 SDS-PAGE 根据分子量大小分离蛋白质不同，它主要根据蛋白质的 pI 分离蛋白质。由于蛋白质的 pI 各不相同，所以对不同靶蛋白质需要选用具有不同 pH 的电泳体系。单独配制不同 pH 的 Native PAGE 电泳胶十分繁琐，为此本公司开发了本产品。它有下列特点:

1. 即开即用，用户不需单独准备各种成分，十分方便。

2. 非变性，电泳过程中蛋白质保持天然的构象和亚基之间的相互作用，得到的蛋白质一般都具有生物活性（而 SDS-PAGE 得到的蛋白没有活性）。

3. 可以用于分析蛋白质和 DNA 或 RNA 的相互作用、蛋白修饰、蛋白构型改变、回收有活性蛋白质等试验。

4. 电泳后可直接用于考染、银染、Western 杂交等实验。

5. 提供具有3种不同pH的缓冲液套装，便于客户选择最适合的缓冲液体系。

运输及保存 常温运输和保存，上样液需低温运输、-20℃保存，保存期为一年。

自备试剂 去离子水、天然 PAGE 蛋白质标准或蛋白质等电电泳标准品 

使用方法

特别说明：如何选择缓冲液 高、中低 pH 缓冲液套装一定要配套使用。选择适当 pH 的缓冲液（包括 上样液，电泳液，配胶液等）对蛋白质非变性 PAGE 非常重要，此又跟靶蛋 白质的 pI 值密切相关。如果缓冲液的 pH 远离靶蛋白的 pI，则蛋白质分子带 电多（电荷密度大），电泳速度快，分辨率高。但过酸过碱又容易使蛋白质结 构变性，失去活性，所以最佳 pH 条件就是在电泳分辨率和维持活性之间寻找 平衡，需要针对每种蛋白质进行摸索或通过滴定曲线来确定，没有通用的电泳 缓冲体系。由于有近半数的蛋白质 pI 在 4-6.5，所以在不知道靶蛋白的 pI 时， 可以先选用高 pH 缓冲系统。

一：配制分离胶

1. 确定浓度。对分子量在 100Kd 以上的蛋白质，可选用 3-5%的胶；对分 子量在 20-150KD 之间的蛋白质，可选用 5-10%的胶；对分子量在 10-80KD 之间的蛋白质，可选用 10-15%的胶。对未知样品，建议使用 7.5%的胶。

2. 配制 10%的 APS（过硫酸铵）：按每 0.1 克过硫酸铵干粉加 1 mL 去离子 水的比例配制 10%的 APS 溶液，该溶液可以在 4℃存放一周。

3. 配制 30%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺（19:1）溶液:在本产品提供的装有 60 克丙烯酰胺干粉的塑料瓶中加入 146 mL 自备的去离子水和 3g 甲叉 双丙烯酰胺,充分摇晃直到溶解（约需 10-20 分钟）即得 200 mL 30%丙 烯酰胺（19:1）溶液。此溶液最好在一个月内用完，必须 4℃避光保存。

4. 配 10 mL 分离胶(如果配制其他体积,请按比例调节各成分用量): 在一个 25 mL 的三角瓶中，先加入 4.2 mL 去离子水、3.3 mL 30%丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺（19：1）溶液和 2.5 mL 4×分离胶配胶液。

5. 摇晃混匀后抽真空 10-15 分钟以去除溶液中的氧气（氧气能抑制丙烯酰 胺聚合反应，不去除的话将影响丙烯酰胺聚合反应）。

6. 加入 50uL 新配制的 10%APS 和 10uL TEMED（这是配制 10 mL 胶的 用量，配制更大体积的胶则按比例增加），迅速摇匀后倒胶。注意：如果 购买的是低 pH 缓冲系统，由于在低 pH 缓冲液中 PAGE 聚合速度降低， 所以需要加倍上述两成分的用量。 7. 在胶面距离顶部 1-1.5 cm 的时候停止灌胶。然后覆盖一层 1-5 mm 厚的 水，使胶顶部液面平整。由于比重不同，水和丙烯酰胺溶液不会混合。

8. 室温聚合 30-60 分钟后，用 1×分离胶配胶液洗涤凝固的胶的顶部，待用。

二：配制浓缩胶（浓缩胶可以提高分辨率，适合于成分复杂的样品，一般使用 浓度为 4%。使用浓缩胶时蛋白质泳动速度主要跟其尺寸和形状相关。因浓缩 胶 pH 跟分离胶 pH 不同，蛋白质可能会发生聚合和沉淀。对成分单一的样品， 可以不用浓缩胶，此时蛋白的泳动速度主要跟其电荷密度，尺寸和形状相关。）

1. 配 10 mL 浓缩胶(如果配制其他体积,请按比例调节各成分用量): 在一个 25 mL 的三角瓶中，先加入 6.2 mL 去离子水、1.3 mL 30%丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺（19：1）溶液和 2.5mL 4×浓缩配胶液。

2. 摇晃混匀后抽真空 10-15 分钟以去除溶液中的氧气（氧气能抑制丙烯酰 胺聚合反应，不去除将影响丙烯酰胺聚合反应）。

3. 按上表用量加入 50uL 10%APS 和 15uL TEMED（这是配制 10 mL 胶 的用量，配制更大体积的胶则用量需按比例增加），迅速摇匀后在已经凝 固的分离胶上倒胶。

4. 在液面达到顶部时停止灌胶，插入梳子。

5. 室温聚合 30-60 分钟，拔出梳子，用 1×电泳液冲洗加样孔。

三：电泳

1. 将凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽加入足够 1×电泳液。注：本 产品提供 10 升电泳液，对低和高 pH 电泳液，用前需将所有干粉溶解在 1 L 水中得 10×电泳液，可以室温放置，用时再稀释成 1×电泳液。一般 不需要再调节 pH，但保险起见，可以用 pH 试纸测试一下 1×电泳液。 低和高 pH 电泳缓冲液的 pH 分别是 4.5 和 8.3。对中 pH 电泳液，其干 粉只能配 1×电泳液，否则不溶解。配制时称取中 pH 电泳液（pH 7.0） 干粉 A, 5.52g, 中 pH 电泳液（pH 7.0）干粉 B 1g 混匀，加去离子水至 彻底溶解，调 pH 到 7.0，定容至 1L。客户根据可实际需要量按比例增减。

2. 连接电极。如果浓缩胶和分离胶的 pH 高于靶蛋白 pI，靶蛋白将带负电荷 并向阳极移动，可以按标准的 SDS-PAGE 方法接通电极（上阴极下阳极）； 如果浓缩胶和分离胶pH低于靶蛋白pI，靶蛋白将带正电荷并向阴级移动， 此时应该下阴极上阳极。

3. 300V 预电泳直到电流不再降低（约需要 30 分钟）以去除残留过硫酸铵。

4. 换电泳液。

5. 在液体蛋白质样品中加入 5×上样液（16 uL 液体样品加 4uL 上样液） 后上样。0.75 mm 厚的胶可以上 10 uL，1.5 mm 厚的胶可以上 20 uL。 在未用加样孔中也要加 1×上样液以防有样品的空道的样品扩散。注意： 如果用考染检测，每个孔的蛋白最好在 50-100 ug 总蛋白，如果银染则 只需要 1ug 即可。样品如果是蛋白质沉淀，可用 1×上样液直接溶解蛋白 质沉淀后再上样。蛋白质溶液或沉淀中不能含有能够改变上样液 pH 的残 留成分（如蛋白质沉淀剂 TCA），用前最好用 pH 试纸测试一下，不在上 样液的 pH 范围时就用酸或碱调到正常范围。大量样品可用透析法调 pH。

6. 上样自备的天然 PAGE 蛋白质标准或等电电泳的标准品（如果有的话）。

7. 用 15 mA（对 0.75 mm 厚的胶）或 30 mM（对 1.5mm 厚的胶）的电 流电泳直到染料移动到分离胶底部。微型胶一般需要 1-2 小时。注意：电 泳过程最好在冷室或有冷却系统，以免电泳产热使蛋白质变性。

8. 终止电泳，取出凝胶进行后续的实验处理（如染色或酶活性检测）。