端粒重复片段扩增（TRAP）试剂盒

端粒重复片段扩增（TRAP）试剂盒

英文名称：TRAP Kit 

运输：低温

保存：负20℃

有效期：1年

货期：1-2天

其他：

产品介绍：

产品及特点

端粒酶存在于 85-90%的肿瘤组织中，因此通过检测端粒酶活性就能早期诊断大多 数肿瘤。目前最常用的检测端粒酶活性的方法就是 TRAP (telomeric repeat amplification protocol，端粒重复片段扩增)，它利用端粒酶能在底物 DNA 末端添加 不同数量的 TTAGGG 序列这一特点，通过 PCR 检测延伸产物而高效检测端粒酶活性。 本产品专门用于快速测定人类细胞端粒酶活性。它具有以下特征：

1. 一站式，提供从细胞裂解到 PCR 的所有试剂，但不含 PAGE 和银染试剂。

2. 一管式操作，端粒酶延伸和 PCR 在同一体系中完成，方便快捷。

3. 提供改进的、长为 150 bp 的内参和含 8 个端粒序列的合成端粒，可有效排除 PCR 假阴性。内参长度远大于 TRAP 产物，不会干扰结果分析。

4. 改良的 TS 模板和 PCR 引物，极大降低了引物二聚体的形成。

5. 既可用于培养细胞，也可用于实体组织。

6. 灵敏度高，最低可以检测到 10 个肿瘤细胞中的端粒酶活性。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂 PAGE 电泳及银染试剂盒

使用方法 一：端粒酶的提取

注意：端粒酶的组成成分中有 RNA，极容易被降解，因此，应该跟提取 RNA 一样，尽 量在低温条件下快速操作、最好使用固相 RNase 清除剂（CAT#:3090）清洁试验台。

1. 对冷冻的实体组织：将50-100 mg冷冻组织在液氮中用预冷的研磨器研磨成粉末， 再转移到预冷的玻璃匀浆器中，加入 200 uL 预冷的 TRAP 细胞裂解液，温和手 动匀浆数次后冰浴 30 分钟，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共 5-6 次，然后直接 进入第 3 步操作。为保证裂解效果，可在显微镜下观察。如果组织样品不足 50-100 mg，可以按比例降低 TRAP 细胞裂解液的用量。

2. 对新鲜的培养细胞和组织：用自备的预冷 PBS 洗涤 105 -106个经过胰酶处理的细 胞或 50-100 mg 新鲜组织，3000 g 4℃离心 5 分钟，弃上清；加入 200 μL 预 冷的 TRAP 细胞裂解液悬浮细胞或组织。对细胞：涡旋振荡 10 秒后置冰浴 30 分 钟，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共 5-6 次。对组织：在冰上用玻璃匀浆器轻柔 匀浆后冰浴 30 分钟，每间隔数分钟涡旋振荡一次，共 5-6 次。如果细胞不足 1 ×106或 50-100 mg，可按比例降低 TRAP 裂解液的用量。

3. 12000-14000 g 4℃离心 20 分钟。

4. 收集 160 uL 上清，先取部分用于测定蛋白质浓度，可通过测定 A215 和 A225 得到，计算公式是蛋白质浓度（ug/uL）=0.144×（A215-A225）×稀释倍数， 也可使用 BCA 法测定蛋白浓度。本试剂盒制备的细胞裂解物的蛋白浓度一般在 10-750 ng/uL。知道各样品的蛋白浓度后，可用 TRAP 细胞裂解液将各样品的蛋 白浓度调成一样，然后按 10 μL/管（至少可分 15 管），放-80℃冷冻保存（可存 放一年）。每个样品可取一管进行热灭活（95℃处理 10 分钟）后再放-80℃冷冻 保存，此管将作为该样品的样品对照。如有必要，可以根据起始细胞或实体组织用 量和最终蛋白量计算出每 ug 蛋白所对应的细胞数或实体组织 mg 数。 

二：TRAP 反应

5. 确定每个样品的用量：可以按每个反应加入相同的细胞裂解物 ug 数或其所对应的 细胞数或实体组织 mg 数来设置 TRAP 反应，为便于分析比较，每个 TRAP 反应 所用的蛋白量（或细胞数）必须一样。由于裂解物中一般都有高浓度的不明 Taq DNA 聚合酶抑制物（TRAP 失败最常见的原因），因此最佳结果往往是在稀释 10-1000 倍后得到。如果需要稀释，每个样品的稀释度也需要保持一致。

6. 在 PCR 管中按下表设置 TRAP 反应（50 uL 反应体系，以 A 和 B 两个样品为例。 A 阴性对照和 B 阴性对照分别是 A 和 B 样品的热灭活产物）： 

7. 吹打混匀后进行 PCR 扩增，扩增条件（仅供参考，用户可优化）

三：PAGE-银染检测及结果解读（本试剂盒不含 PAGE-银染检测试剂盒）

8. 取 5uL PCR 反应液进行 10%非变性 PAGE 电泳-银染显色实验（需另购试剂盒）。 如果背景高（主要是由反应体系中的蛋白成分引起），可以 PCR 产物纯化再进行 PAGE 电泳和银染。 

9. 跟预期结果（见下表）比较。如果结果跟下表不一致，则需要按具体情况分析原因。

注：本试剂盒所用引物产生的典型 TRAP 条带最小条带为 59bp。当样品端粒活性太强， 其端粒产物在扩增时会与 150bp 内参竞争引物，故可能不会出现 150bp 条带。