牛丘疹性口炎病毒染料法荧光定量PCR试剂盒

牛丘疹性口炎病毒染料法荧光定量PCR试剂盒

英文名称：Bovine Papular Stomatitis Virus(BPSV)

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品介绍：

产品及特点

牛丘疹性口炎病毒(Bovine Papular Stomatitis Virus，BPSV) 会引起牛丘疹性 口炎，是一种世界性疾病，该疾病主要在口腔黏膜、鼻镜、鼻孔的上皮出现病变，引起 火山口样溃疡，其非典型临床症状的增生性病变常涉及到腿部并比较严重，甚至威胁到 动物的生命，本病的流行特点以危害牛为主，潜伏期 3-8 天，幼牛易发病，对养牛业有 较大影响，因此牛丘疹性口炎病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用， 为此本公司开发了简单快捷的牛丘疹性口炎病毒染料法荧光定量 PCR 检测试剂盒，它 具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供病毒样品。

2. 根据牛细小病毒保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。

3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。

4. 一管式荧光定量 PCR 检测，避免后续污染。

5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。

6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。 

运输及保存 低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂 DNA 模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。

使用方法 一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）

1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。

2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（最好用带芯枪头，下同）。

4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μ

三、设置 qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）

10. 如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于 PCR 阳性对照。如果做 2-3 次重复，则反应设置数量相应增加 2 或 3 倍。

11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分样品管

N+2 个PCR 阴性对照管

PCR 阳性

对照管（2-7 管）

2×qPCR MagicMix

（棕色管）

10 μL 10 μL 各 10 μL

水牛正痘病毒 PCR

引物混合液（白盖）

2 μL 2 μL 各 2 μL

自备 10×ROX (见注) 2 μL 2 μL 各 2 μL

N+2 待测样品 DNA 模板 6 μL 不加 不加

第 7 步所得 PCR 阳性对照

稀释液（2-7 号）

不加 不加

各 6μL（2 号样到

2 号管，3 号样到 3号管…）

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，则用水替代。

12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。

过程 温度 时间 

预变性 94℃ 5 分钟

PCR 反应

（30 个循环）

92℃ 60 秒

58℃ 60 秒

74℃ 60 秒

13. 数据采集

具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA 时，最大吸收光谱在 471 nm，结合 DNA 时的最大吸收光谱在 500 nm，最大发射光谱在 530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。

四、数据处理

14. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的log 值，再推算出其浓度。

15. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。