传染性胰脏坏死病病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

传染性胰脏坏死病病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

英文名称：Infectious Pancreatic Necrosis Virus(IPNV)

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他：

产品介绍：

产品及特点

传染性脾肾坏死病病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus，ISKNV）会引起传染性脾肾坏死病，是以脾、肾坏死为主要病理特征的一种病毒性疾病。病鱼嘴张大，呼吸加快，食欲下降，鱼体变黑，有时有抽筋样颤动；头部充血，口四周和眼出血；脾脏肿大、糜烂和充血，呈紫黑色；肾脏肿大、充血和溃烂；肝脏肿大，有缺血状、土黄色或有淤血点等症状；常见有腹水，肠内有时充满黄色粘稠物，胆囊肿大；鳃贫血，发白，伴有寄生虫或细菌感染出现出血、腐烂等现象。传染性脾肾坏死病主要流行于我国南方淡水养殖的鳜中，具有很高的死亡率，对鳜养殖业造成很大的威胁，严重危害我国鳜养殖业发展，因此传染性脾肾坏死病病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用，为此本公司开发了简单快捷的传染性脾肾坏死病病毒染料法荧光定量PCR检测试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供病毒样品。

2. 根据传染性脾肾坏死病病毒保守序列设计的专一性引物，与相关病毒无交叉反应。

3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。

4. 一管式荧光定量PCR检测，避免后续污染。

5. 本试剂盒足够50次20μL反应体系的荧光定量PCR。

6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

运输及保存 低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂 DNA模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。

使用方法 一、稀释PCR阳性对照（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）

1. 注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。

2. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

3. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液（最好用带芯枪头，下同）。

4. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

5. 换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

7. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

8. 如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号（浓度为1×10E4 拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝）或第5号（浓度为1×10E5 拷贝/μL，10μL相当于10万拷贝）再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品，则PC和NC的体积也必须是200μL。

9. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒DNAout或其升级版柱式病毒DNAout。本试剂盒免费赠送15次一管式病毒DNAout，其使用手册可从本公司网站www.tiandz.com通过搜索产品名称一管式病毒DNAout或产品编号3674下载。

三、设置qPCR反应（20 μL体系，在样品制备室进行）

10. 如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。

11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分 样品管

N+2个 PCR阴性对照管 PCR阳性

对照管（2-7管）

2×qPCR MagicMix

（棕色管） 10 μL 10 μL 各10 μL

传染性脾肾坏死病病毒PCR

引物混合液（白盖） 2 μL 2 μL 各2 μL

自备10×ROX (见注) 2 μL 2 μL 各2 μL

 N+2待测样品DNA模板 6 μL 不加 不加

第7步所得PCR阳性对照

稀释液（2-7号） 不加 不加 各6μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）

注:仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX，则用水替代。

12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR（具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化）。

过程 温度 时间

预变性 94℃ 5分钟

PCR反应

（30个循环） 94℃ 60 秒

56℃ 60 秒

72℃ 60 秒

13. 数据采集

具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合DNA时，最大吸收光谱在471 nm，结合DNA时的最大吸收光谱在500 nm，最大发射光谱在530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。

四、数据处理

14. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

15. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。