嗜麦芽窄食单胞菌染料法荧光定量PCR试剂盒

嗜麦芽窄食单胞菌染料法荧光定量PCR试剂盒

英文名称：Stenotrophomonas maltophilia

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品及特点

嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)广泛存在于水，土壤， 动物体内，为条件致病菌，随着临床抗生素和免疫抑制的广泛和大剂量应用，其 分离率在非发酵菌属中呈上升趋势，因该菌对多种抗生素耐药，因而给临床治疗 带来很大困难，对人体健康造成严重损害，因此快速检测嗜麦芽窄食单胞菌具有 重要意义。荧光定量 PCR 是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以染料法 荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测嗜麦芽窄食单胞菌的试剂盒，它具有 下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。

2. 特异性高，引物是根据人嗜麦芽窄食单胞菌高度保守区设计,不会扩增其他细 菌和微生物。

3. 引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规 PCR 高 100 倍。

4. 提供无传染性的 PCR 阳性对照，便于区分假阴性样品。

5. 一管式操作，荧光 PCR 检测，不容易产生环境污染。

6. 本产品只能用于科研，本试剂盒足够 50 次 20uL 体系的 PCR。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

自备试剂 样品 DNA。

使用方法 一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。 由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头， 下同）。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的标准曲 线样品的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝）或 第 5 号（浓度为 1×10E5 拷贝/μL，10μL 相当于 10 万拷贝）再加上一定 量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。如果每次制备需要 200μL 样品，则 PC 和 NC 的体积也必须是 200μL。

8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数细菌 DNA 提取试剂 盒兼容。也可以选购本公司的细菌 DNAout 或柱式细菌 DNAout。本试剂 盒免费赠送 50 次免 DNA 提取的DNA 释放剂

三、设置 qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9. 如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线样品。如果做 2-3 次重复，则反应设置数量相应增加 2 或 3 倍。

10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后最后加）：

成分 样品管 N+2 个 PCR 阴性 对照管 标准曲线 样品管（2-7 管）

2×qPCR MagicMix （棕色管） 10 μL 10 μL 各 10 μL

嗜麦芽窄食单胞菌 PCR 引物混合液（白盖） 2 μL 2 μL 各 2 μL

自备 10×ROX (见注) 2 μL 2 μL 各 2 μL

待测样品 DNA 模板 6 μL 不加 不加

第 7 步所得标准曲线样 不加 不加 各 6μL（2 号样到 品稀释液（2-7 号） 2 号管，3 号样到 3 号管…）

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、 RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，则用水替代。

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同 而自行优化）。 四、荧光定量 PCR 反应参数

过程 温度 时间

预变性 94℃ 5 min

PCR 反应 （35 个循环） 94℃ 0.5 min 50℃ 0.5 min（采集 SYBR 通道的 荧光信号） 72℃ 0.5 min

最后延伸 72℃ 10 min

五、数据处理

12. 以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待 测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓 度。

五、电泳检测

13. 如果有必要电泳确认，可取 10-20 uL PCR 产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产 物的大小为 400 bp。