一步法质粒DNAout

一步法质粒DNAout

英文名称：One-Step Plasmid DNAOUT 

运输：常温

保存：常温

有效期：1年

货期：1-2天

其他：

产品介绍：

一步法质粒DNA小提

产品及特点

基于碱变性原理的质粒小量制备(Miniprep)是分子克隆研究中最常用的方法之一，其操作包括三种溶液处理，一般需要 30 分钟左右的时间才能得到可以上柱的质粒DNA 初提液。本产品采用基因自主开发的一步式细菌裂解技术，只需要一种溶液处理即可以完成细菌裂解，并且裂解物可以直接上柱纯化质粒 DNA，比碱变性法快捷约 20 分钟。本产品的主要特点是:

1. 一步式，提取一个样品只需 5 分钟左右，比传统的碱变性方法快捷。

2. 适用于高拷贝、中拷贝和低拷贝质粒的提取。适用于各种 E.coli 宿主菌。

3. 质粒 DNA 产量跟经典碱变性法相当，一般 1-5mL 可以得到 3-15ug（对低拷贝质粒）和 5-35ug（对高拷贝质粒）。

4. 所得质粒 DNA 呈超螺旋结构的比例比碱变性法更高。

5. 基因组 DNA 污染少。但由于操作太快，溶液中的 RNase 来不及降解 RNA，一般会有少量 RNA 污染，但不影响后续实验。

6. 可以直接用于电泳、酶切、PCR、细菌转化、分子克隆、测序等后续实验。

运输及保存 常温运输及保存，溶液 A 长期保存需要放 4℃，有效期一年。

自备试剂 无

使用方法

 1、 用塑料离心管收集 0.5-5 mL 过夜培养的饱和新鲜菌液，室温 14000g 离心半分钟，弃上清（培养基）。也可以使用-20℃冻存的细菌沉淀和 4℃放置过夜的饱和细菌培养液，但质粒回收效率稍低。如果是中拷贝和高拷贝质粒，使用 1.5mL 菌液即可，如果是低拷贝质粒，最好使用 3-5mL 菌液。常见质粒拷贝数请参考附表。

2、 在细菌沉淀中加入 700uL 溶液 A，充分吹打或涡旋振荡半分钟。

3、 将裂解液全部转移到离心吸附柱中，直接离心。如果静置 3-5 分钟后再离心，会提高质粒产量 10%左右。

4、 室温 14000g 离心 1 分钟，弃穿透液。如果使用 3-5mL 起始菌液，则此步的离

心时间可以延长 1 分钟以确保所有液体成功过柱，吸附柱中没有残留液体。

5、 在离心吸附柱中加入 700uL 的通用洗柱液，室温 14000g 离心半分钟，弃穿透。

6、 室温 14000g 离心半分钟，甩尽残留液体。注意：此步不能省略。 

7、 将离心柱置于一个自备的 1.5 mL 塑料离心管中，在离心柱中加入 30-50uL DNA洗脱液 2.0(对低拷贝质粒建议用 30uL 洗脱，对高拷贝质粒建议用 50uL 洗脱)。

8、 室温 14000g 离心半分钟，离心管底溶液即质粒 DNA，可以直接用于后续实（浓度测定、酶切、电泳和测序）或放冰箱长期保存。

注意：本方法提取的质粒 DNA 有如下特点：

1、因为没有使用剧烈的碱变性步骤，所以质粒呈现天然的超螺旋结构的比例较大。

2、由于整个操作非常快速，又没有使用碱来降解 RNA，所以试剂中的 RNase 都来

不及把细菌的内源 RNA 彻底降解，故所得质粒比碱变性法提取的质粒有更多的

RNA 污染，因此不建议使用测 OD 的方法确定质粒 DNA 的浓度，故最好采用电

泳比较法，即通过比较质粒 DNA 跟浓度已知的 DNA marker 的相对亮度来确定

质粒的浓度。注意：RNA 污染一般不影响电泳、酶切和测序。

3、如果需要进一步去除 RNA 污染，可以在第 5 步后再增加一步洗柱操作，即在心吸附柱中加入 300uL 的通用洗柱液，室温 14000g 离心半分钟，弃穿透液，再进入下一步。

4、 一般 1-5mL 菌液可以得到 3-15ug（对低拷贝质粒）或 5-35ug（对高拷贝质）质粒 DNA。如果需要进一步提高质粒 DNA 产量，可以再加 30-50uL DNA 洗脱液 2.0 到离心吸附柱中再次洗脱，可以得到相当于第一次洗脱量 10-20%的质粒DNA。也可以将第一次洗脱得到的质粒 DNA 溶液再加到离心吸附柱中洗脱，可以使质粒 DNA 产量提高 10-20%。