5’RACE试剂盒

5’RACE试剂盒

英文名称：5′-RACE Kit 

运输：低温

保存：负20℃

有效期：1年

货期：1-2天

其他：

产品介绍：

克隆RNA的5‘端

产品及特点

研究真核基因的最基础的工作之一就是确定其转录终止位点，目前最通用的方 法是 3′-RACE 法，RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是 Frohman 发明的、通过 PCR 快速克隆 cDNA 末端的技术，它在不建立 cDNA 文库的前提下， 利用已知 cDNA 序列设计引物，通过往两端延伸和扩增获得其 3′-端序列。本试剂 盒就是根据 3′-RACE 原理而开发，它具有下列特点：

1. 即开即用，客户不需要单独准备各种材料。

2. 反应条件经过精心优化，包括使用无 RNase H 活性的 MMLV 和优化的引物。 

自备试剂 Poly(A) RNA（或总 RNA）、基因专一性引物 A、基因专一性引物 B、超纯水。

运输及保存 低温运输、-20℃保存、有效期一年。 

使用方法 一：引物的设计和准备工作 

利用已道序列的区域设计基因专一性引物三条（A、B），其中引物 B 和 A 引物 比较，靠 3’端 10-30 个碱基，类似巢式 PCR 的引物设计。自备的基因专一性引物 的 Tm 最好跟 3′-RACE 引物 B 和引物 C 的一致，即 Tm 为 58℃。引物合成后加 超纯水使其浓度为 10 μM，放冰上待用。 

二：利用含 Oligo(dT)的 3’-RACE 引物 A 进行逆转录 

注意：MMLV 酶使用前必须短暂离心，因为它含 50%甘油，及其粘稠，否则将取不 到所需体积。

1. 在一个 PCR 管中，加入以下组分： 

成分 用量

Poly(A) RNA（或总RNA ） 0.2-2 μg（5 μg）

3′-RACE引物A（10 μM） 1 μL

MMLV Buffer (含dNTP溶液) 5 μL

RNase-Free水 补至19 μL

合计 19 μL

注意：如果可能，最好使用Poly(A) RNA作为模板。

2. 65℃保温 5 分钟, 展开 RNA 的二级结构，立即冰浴待用。

3. 在冰浴的 PCR 管中加入 1 μL MMLV 逆转录酶-RI 混合物。

4. 先 37℃保温 60 分钟，再 42℃保温 30 分钟进行逆转录反应，最后 50℃保温 10 分钟终止反应。

5. 加入 0.5 mL RNase-free 水稀释上步得到的 cDNA，冰浴待用。长期放置需要 放-20℃保存。 

三：利用基因专一性引物 A 和 3′ RACE 引物 B 进行第一轮 PCR

6. 用不同量的 RT 反应液（即稀释后的 cDNA 模板）设置 PCR，样品组需要设置 模板用量梯度，单位：μL。 

7. 按下列参数进行 cDNA 第二链的合成和 PCR：

第 1 步，cDNA 第二链的合成：52-60℃ 2 分，72℃ 40 分（此步的目地是合 成第二链的 cDNA，复性温度需要根据自备基因专一性引物 A 的 Tm 值决定， 一般可以从 55℃开始）。

 第二步 PCR 循环：94℃ 1 分钟，52-60℃ 1 分，72℃ 3 分（此步为 PCR 扩 增，复性温度需要根据自备基因专一性引物 A 的 Tm 值决定，一般可以从 55℃ 开始）。 最后延伸：72℃ 15 分

8. 取 5 μL PCR 反应液进行琼脂糖凝胶电泳以确认 PCR 扩增产物。若得到目的扩 增产物需要用于后续实验，请于-20℃保存；若没有得到目的扩增产物，可按下 列步骤进行巢式 PCR 反应。

四：利用基因专一性引物 B 和 3′ 

9. 将上轮 PCR 产物（4 管）用水稀释约 20 倍（在 50μL PCR 反应液中加入 1mL 超纯水），然后分别作为模板进行巢式 PCR 扩增。

10. PCR 反应。按下列条件进行 PCR： 第 1-30 次循环：94℃ 1 分钟，52-60℃ 1 分，72℃ 3 分（复性温度需要根 据自备基因专一性引物 B 的 Tm 值进行优化，一般可以从 55℃开始）。最后延 伸：72℃ 15 分。 

11. 电泳检测。然后根据实验结果进行 DNA 测序或 TA 克隆。