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| 别名: | 欧洲放线菌染料法荧光定量PCR试剂盒 | ||
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| 储存条件: | 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。 | ||
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| 货号 | 规格 | 可用库存 | 销售价(RMB) | 您的折扣价(RMB) | 购买数量 |
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| 储存条件: | 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。 |
欧洲放线菌染料法荧光定量PCR试剂盒
英文名称：Actinomyces europaeus
运输：低温
保存：负20度
有效期：一年
货期：2-3周
其他：
产品介绍：
产品及特点
欧洲放线菌（Actinomyces europaeus）是放线菌的一种，常常会在耳部等引起感染，感染具有多发性、复发性等特点，难以完全治愈，对人体健康造成较长时间的损害，因此检测欧洲放线菌具有重要的意义。本试剂盒根据荧光定量PCR 原理开发，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。
2. 特异性高，引物是根据欧洲放线菌高度保守区设计,不会扩增其他细菌。
3. 引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规 PCR 高 100 倍。
4. 提供无传染性的 PCR 阳性对照，便于区分假阴性样品。
5. 一管式操作，荧光 PCR 检测，不容易产生环境污染。
6. 本产品只能用于科研，本试剂盒足够 50 次 20μL 体系的 PCR。
运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
自备试剂 样品 DNA。
使用方法
一、制备标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 阳性对照（其浓度为 1×10E8 拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7. 用自选方法纯化样品的 DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
8. 如果有 N 个样品，则需要进行 N+2 个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。本试剂盒免费赠送 20 次免DNA 提取的核酸释放剂试用装，该释放剂的裂解液可以直接作为PCR 模板，省略了 DNA 提取步骤。
三、设置 qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9. 如果进行定量分析，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线样品。如果做定性分析，则 6 个标准曲线样品只选一个做（可以选 4 号，其余样品不变）。以下只介绍定量分析的反应设置。
10. 在标记管中按下表加入各成分：
成分
N+2 个
样品管
PCR 阴性
对照管
标准曲线
样品管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL欧洲放线菌 PCR 引物混合液 2 μL 2 μL 各 2 μL自备 10×ROX (见注) 2 μL 2 μL 各 2 μL
N+2 个待测样品 DNA 模板 6 μL 不加 不加自备超纯水 不加 6 μL 不加
第 7 步所得标准曲线样品稀释液（2-7 号）
不加 不加各 6μL（2 号样到
2 号管，3 号样到 3号管…）
注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用ROX，则用水替代。
11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。
四、荧光定量 PCR 反应参数
过程 温度 时间
预变性 95℃ 3 min
PCR 反应（40 个循环）
95℃ 15 sec60℃
30sec（采集 SYBR 通道的荧光信号）
五、数据处理
12. 设定 60℃-96℃范围的融解曲线分析，排除假阳性。
13. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
14. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 30。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 25。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 30 则为阴性，如果小于或等于 25 则为阳性。如果在 25-30 之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 30 则为阴性，如果小于 30，则为阳性。
