狷羚疱疹病毒1型染料法荧光定量PCR试剂盒

狷羚疱疹病毒1型染料法荧光定量PCR试剂盒

英文名称：Alcelephine Herpesvirus 1(AlHV-1

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品介绍：

产品及特点 

非洲猪瘟(African Swine Fever、ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine FeverVirus、ASFV) 引起猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病，病死率几乎高达100%， ASF 最近在我国爆发，给我国养猪业造成重大损失，因此 ASFV 的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本公司产品开发非洲猪瘟病毒染料法荧光定量 PCR 试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供病毒 DNA 模板。

2. 引物根据非洲猪瘟病毒 P72 基因专一区设计，特异性高。

3. 荧光定量 PCR 检测，比常规 PCR 更加灵敏。

4. 一管式闭管操作，降低了交叉污染。

5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。

6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

运输及保存 低温运输、-20℃保存，有效期一年。 

自备试剂 DNA 模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。

 使用方法 

一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）

1. 注意：由于阳性对照浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作为阳性对照。

2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液（最好用带芯枪头，下同）。

4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

8. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL PCR 阳性对照的 10000 倍稀释的（稀释后浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝，可以将 10μL 原液加入到 990μL 自备 TE 溶液中，充分混匀，此为 100 倍稀释液。再取 10μL 此稀释液加入到 990μL 自备 TE 溶液中，充分混匀，此为 10000 倍稀释液）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 DNA。

9. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 20 次核酸释放剂试用装，

三、设置 qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）

10. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，中 N+2 个用于上步得到的N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号阳性对照稀释液，浓度为 14810 拷贝/μL）。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个，其余不变。

11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分

样品管

N+2 个

PCR 阴性

对照管

PCR 阳性

对照管（2-7 管）

2×qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL

非洲猪瘟病毒染料法 qPCR

引物混合液

2 μL 2 μL 各 2 μL

自备 10×ROX (见注) 2 μL 2 μL 各 2 μL

N+2 待测样品 cDNA 模板 6 μL 不加 不加

第 7 步所得 PCR 阳性对照

稀释液（2-7 号）

不加 不加

各 6μL（2 号样到

2 号管，3 号样到 3号管…）

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪

器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene

3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，则用水替代。

12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。

过程 温度 时间

预变性 95℃ 5 min

PCR 反应

（40 个循环）

95℃ 15 sec

60℃ 1 min，（采集 FAM 通道的荧光信号）

按仪器预设程序进行熔解曲线分析

四、数据处理

13. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 cDNA 浓度的log 值，再推算出其浓度。

14. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。