禽脑脊髓炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

禽脑脊髓炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

英文名称：Avian Encephalomyelitis Virus(AEV)

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品介绍：

产品及特点

禽脑脊髓炎病毒（Avian Encephalomyelitis Virus，AEV）会引起禽脑脊 髓炎，是主要侵害幼鸡的一种病毒病，以运动失调和头颈部震颤为特征，产蛋鸡 可出现一时性产蛋急剧下降，最后可能会因饮食不足而衰竭死亡。该病毒会给养 鸡业造成较大的经济损失，因此灵敏快捷的诊断产品具有重要的意义。本产品基 于荧光定量 RT-PCR 原理开发。它具有下列特点：

1. 一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。

2. 根据禽脑脊髓炎病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。

3. 基于染料法 qRT-PCR 检测，灵敏度比常规 RT-PCR 高 10-100 倍，可以达 到至少 500 拷贝/反应。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技术，RT 和 PCR 两步在一个试管内完成，不需要中 间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的 RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。阳性对照需要因易污染其他成分需 要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供 DNA 片段作为阳性对照。 自备试剂 样品 RNA

使用方法

一、稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非 常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行）。 1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入 45 μL 荧 光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

2. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供)，充分 震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

3. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

4. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。重 复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。 二、样品 RNA 的制备

5. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的阳性对照 梯度稀释液中的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝） 再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品 体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。

6. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提 取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 20 次免 RNA 提取的核酸释放剂试 用装，

三、设置 RT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

7. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用 于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线。如 果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用 于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用 于 PCR 阳性对照（用第 4 号阳性对照稀释液做模板）。下面只描述定量分析 的步骤，定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个，其余不变。

8. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加）： 成分 N+2 个制备 所得样品 RT-PCR 阴性对照 RT-PCR 阳性 对照（2-7 管） 2×qRT-PCR 缓冲液 10μL 10μL 各 10μL 禽脑脊髓炎病毒 RT-PCR 引物混合物 2μL 2μL 各 2μL 50×ROX (见注) 0.4μL 0.4μL 各 0.4μL N+个制备的 RNA 模板 5.6μL 不加 不加 自备超纯水 不加 5.6μL 不加 稀释所得 6 个阳性对照 不加 不加 各 5.6μL（2 号样 到 2 号管，3 号样 到 3 号管…） 10×qRT-PCR 酶混合液 2μL 2μL 2μL

注:需使用 ROX 染料 I 的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、 Step-One、Step-One Plus。 需使用 ROX 染料 II 的机型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research 的 Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。 不需要使用 ROX 的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。

9. 上机后按下面参数进行 RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。 过程 温度 时间 RT（逆转录） 50℃ 30 分钟 预变性 94℃ 10 分钟 RT - PCR 反应 （40 个循环） 95℃ 15 秒 55℃ 30 秒（采集 FAM 通道的荧光信号） 72℃ 50 秒

四、数据处理

10. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值 为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

11. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于 或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于 或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等 于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大 于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。