双歧杆菌属通用染料法荧光定量PCR试剂盒

双歧杆菌属通用染料法荧光定量PCR试剂盒

英文名称：Bifidobacterium spp.

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品介绍：

产品及特点

双歧杆菌（Bifidobacterium）是一类存在于人体中非常重要的专性厌氧菌，于1899 年首先在母乳喂养的健康婴儿粪便中发现并分离，研究证实双歧杆菌具有平衡肠道菌群、降胆固醇、延缓衰老及抗肿瘤等生理功能，是人体益生菌群的主要组成。添加

双歧杆菌的微生态制剂开发研究已成为一大热点，广泛应用于食品、保健和医疗等领域。但不断有报道指出国内外市场上双歧杆菌微生态制剂标示名称混乱，很多国家市场上双歧杆菌制品假冒代替现象严重。针对该现象，开发了针对双歧杆菌特异性检测试剂盒，本产品利用实时荧光定量 PCR 技术，通过荧光染料实时显示样品双歧杆菌模板 DNA的量, 并通过坐标曲线表示出来, 结果直观准确。它具有下列特点：

1. 根据双歧杆菌属 tuf 基因，设计的针对双歧杆菌的 PCR 引物，克服了其他细菌的干扰。

2. 即开即用，用户只需要提供样品模板，操作简单，定量准确快速。

3. 荧光定量 PCR 检测，反应特异性强。

4. 本试剂盒可以进行 100 次 20uL 体系的 qPCR 反应。

5. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。 

运输及保存 低温运输、-20℃保存(B 袋的阳性对照一定要放扩增区，A 袋的试剂放样品准备区)，有效期一年。

自备试剂 DNA 模板。

使用方法 一、样品 DNA 的制备

1. 用自选方法纯化双歧杆菌样品的 DNA，也可以另购本公司的细菌 DNAout，此产品跟本试剂盒兼容。

二、引物的制备（在样品制备室进行）

2. 按引物标签提示在装引物干粉的管中直接加入适量的超纯水（加入量见引物试管上

的标签），使得两条引物的浓度均为 10 uM（10pmol/uL）。

三、稀释阳性对照（以 10E3-10E7 这 5 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体菌做阳性对照，只提供可以直接使用的长为 339bp 的 DNA 片段作为阳性对照。

3. 标记 5 个离心管，分别为 7，6，5，4，3 号。

4. 用带芯枪头分别加入 45 μL 超纯水（最好用带芯枪头，下同）。

5. 先将本试剂盒提供的双歧杆菌 Tuf 基因阳性对照用超纯水 10 倍梯度稀释到 10E8拷贝/μL。放冰上待用。

6. 在 7 号管中加入 5 μL 10E8 拷贝/μL 的双歧杆菌 Tuf 基因阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

7. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 10E7 拷贝/μL 的双歧杆菌 Tuf 基因阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

8. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 10E6 拷贝/μL 的双歧杆菌 Tuf 基因阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

9. 换枪头，在 4 号管中加入 5 μL 10E5 拷贝/μL 的双歧杆菌 Tuf 基因阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 10E4 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

10. 换枪头，在 3 号管中加入 5 μL 10E4 拷贝/μL 的双歧杆菌 Tuf 基因阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 10E3 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用

三、设置 PCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）

11. 在 PCR 管中加入下列成分（待测样品需要做三次重复，下表只列出一次。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有成分盖上盖子储存好后最后加）：

成分 样品 阴性对照 阳性对照（1-6 管）

2×qPCR Mix 10 μL 10 μL 各 10 μL

Tuf 基因专一性引物 A，10 uM 1 μL 1 μL 各 1 μL

Tuf 基因专一性引物 B，10 uM 1 μL 1 μL 各 1 μL

自备 10×ROX (见注) 2 μL 2 μL 各 2 μL

待测样品 DNA 模板 1-5 μL 不加 不加

阳性对照（1-6 号） 不加 不加 各 5μL（1 号到 1

号，2 号到 2 号…）

补水到 20 μL 20 μL 20 μL

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX。

12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。

过程 温度 时间

预变性 95℃ 5 分钟

PCR 反应

（45 个循环）

95℃ 10 秒

58℃ 45 秒

72℃ 1 分钟

复性 72℃ 5 分钟

13. 数据采集具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA 时，最大吸收光谱在 471 nm，结合 DNA 时的最大吸收光谱在 500 nm，最大发射光谱在 530 nm。

四、数据处理

14. 以 Tuf 基因序列阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品浓度的 log 为横轴，以 Ct 值为纵轴，通过待测样品的 Ct 值计算出样品 DNA 的浓度