艰难梭状芽孢杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒

艰难梭状芽孢杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒

英文名称：Clostridium difficile

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品介绍：

产品及特点

艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)属厌氧性细菌，一般寄生在人的肠道内。如果过度服用某些抗生素，艰难梭菌的菌群生长速度加快，影响肠道中其他细菌，引发炎症。该细菌会引起伪膜性肠炎，临床表现为腹泻、腹痛、伴有全身中毒症状，症状突然开始，并伴随血压低，严重时能致死。通常还伴有发烧，白细胞增多，之后可导致死亡，是很严重的一类疾病。该细菌还会引起抗生素相关性腹泻，在体内的潜伏期为5-10天，之后导致大量的棕色或水状腹泻，持续1周左右。除上述疾病外，艰难梭菌尚可引起肾盂肾炎、脑膜炎、腹腔及阴道感染、菌血症和气性坏疽等。近年来该菌已成为医院内感染的病原菌之一，日益被人们所重视，因此快速检测艰难梭状芽孢杆菌具有重要意义。荧光定量PCR是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以染料法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测艰难梭状芽孢杆菌的试剂盒，它具有下列特点：

1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。

2.引物和探针经过优化，灵敏性高。

3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4.特异性高，引物是根据人艰难梭状芽孢杆菌高度保守的VP1区设计，不会跟其他微生物的DNA发生交叉反应。

5.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。

6.本产品只能用于科研。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂 样品DNA。

使用方法 一、稀释标准曲线样品（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1.标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

2.用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3.在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4.换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5.换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7.如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。

8.用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数细菌DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的细菌DNAout或柱式细菌DNAout。本试剂盒免费赠送50次免DNA提取的DNA释放剂，本产品的裂解液可以直接作为PCR模板，省略了DNA提取步骤。

三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

9.如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。

10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分 样品管

N+2个 PCR阴性对照管 标准曲线

样品管（2-7管）

2×Probe qPCR MagicMix（本色盖） 10 μL 10 μL 各10 μL

艰难梭状芽孢杆菌 qPCR探针（绿盖） 2 μL 2 μL 各2 μL

艰难梭状芽孢杆菌 PCR引物混合液（白盖） 2 μL 2 μL 各2 μL

 待测样品DNA模板 6 μL 不加 不加

第7步所得标准曲线样品稀释液（2-7号） 不加 不加 各6μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）

11.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：

过程 温度 时间

预变性 94℃ 5 min

PCR反应

（40个循环） 94℃ 0.5 min

50℃ 0.5 min（采集FAM通道的荧光信号）

72℃ 0.5 min

最后延伸 72℃ 10min

五、数据处理

12.以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

六、电泳检测

13.如果有必要电泳确认，可取10-20μL PCR产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产物的大小为400 bp。但电泳非常容易污染实验环境，建议不轻易采纳。