基孔肯尼雅病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

基孔肯尼雅病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

英文名称：Chikungunya Virus(CHIKV)

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品介绍：

产品及特点

孔肯尼雅病毒(Chikungunya Virus，CHIKV)是一种RNA病毒，会引起基孔肯雅病，发热病人常突然起病，寒战、发热，体温可达39℃，伴有头痛、恶心、呕吐、食欲减退，淋巴结肿大。一般发热1~7天即可退热，约3天后再次出现较轻微发热，持续3~5天恢复正常，有些患者可有结膜充血和轻度结膜炎表现，关节疼痛与发热同时，患者全身的多个关节和脊椎出现十分剧烈的疼痛，且病情发展迅速，往往在数分钟或数小时内关节功能丧失，不能活动，因此灵敏快捷的诊断产品具有重要的意义。本产品基于PCR原理开发。它具有下列特点：

1. 使用本公司开发的一管式荧光定量 RT-PCR试剂盒，灵敏度比常规 RT-PCR高2-3 个数量级，可以达到几百拷贝/反应。

2. 封闭式，避免扩张产物对后续实验的污染。

3. 根据猪瘟病毒的保守序列设计的专一性 RT-PCR 引物，与相关病毒无交叉反应。

4. 即开即用，用户只需要提供样品模板，操作简单，定量准确快速。

5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 RT-PCR。

6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。 

运输及保存 低温运输、-20℃保存(阳性对照最好分开放置)，有效期一年。

自备试剂 RNA 模板 使用方法 一、 稀释阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。

1. 注意：本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的核酸片段作为阳 性对照。下列稀释操作一定要在独立的区域进行，不能污染其他成分。

2. 标记 6 个 RNase-free 离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

3. 用带芯 RNase-free 枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液。

4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)， 充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头，从 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充 分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备

8. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照）， 一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的阳性对照梯度稀释液 中的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝）或第 5 号（浓 度为 1×10E5 拷贝/μL，10μL 相当于 10 万拷贝）再加上一定量的水作为制备的 阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。 可以用水作为制备的阴性对照。

9. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试 剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 15 次 RNA 病毒裂解液试用装（一管式病毒 RNAout 的成分）

三、设置 RT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

10. 如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个 样品，1 个用于 RT-PCR 阴性对照，6 个用于 RT-PCR 阳性对照）。如果做 2-3 次重复，则反应设置数量相应增加。

11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕 后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加）：

成分 N+2 个制备 所得样品 RT-PCR 阴性对照 RT-PCR 阳性 对照（2-7 管） 2×qRT-PCR 缓冲液 10μL 10μL 各 10μL 猪瘟病毒 RT-PCR 引物混合物 2μL 2μL 各 2μL 50×ROX (见注) 0.4μL 0.4μL 各 0.4μL 样品制备所得 RNA 模 板（来于第 8 步） 5.6μL 不加 不加 稀释所得 6 个阳性对照 （来于第 7 步） 不加 不加 各 5.6μL（2 号样 到 2 号管，3 号样 到 3 号管…） 10×qRT-PCR酶混合液 2μL 2μL 2μL

注:需使用 ROX 染料 I 的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、 Step-One、Step-One Plus。 需使用 ROX 染料 II 的机型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research 的 Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。 不 需 要 使 用 ROX 的机型： Thermal Cycle Dice Real Time System ， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、 RotorGene 6000。

12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 RT-PCR（具体 RT-PCR 参数可以根据仪器不 同而自行优化）。

过程 温度 时间 RT（逆转录） 50℃ 15-30 分钟 预变性 94℃ 2 分钟 RT - PCR 反应 （30 个循环） 94℃ 30 秒 55℃ 30 秒 72℃ 60 秒（采集 SYBR 通道的荧光信号） 按仪器预设程序进行溶解曲线分析

四、数据处理

13. 如果 PCR 阳性对照和 PCR 阴性对照均得到预期阳性和阴性结果，则说明 PCR 有 效，可以进行后续分析。以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制 标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值， 再推算出其浓度。

14. 如果 PCR 阳性对照或 PCR 阴性对照任何一个没有得到预期阳性和阴性结果（如 PCR 阳性对照没有扩增，或阴性对照出现扩增），则说明 PCR 实验无效或污染， 不需要进行后续分析，需要重复 PCR 或请跟厂家联系。

15. 如果样品制备阳性对照或样品制备阴性对照均得到预期阳性和阴性结果，说明样品 制备操作有效，实验结果有效。

16. 如果样品制备阳性对照或样品制备阴性对照任何一个没有得到预期结果（如样品制 备阳性对照无扩增，或样品制备阴性对照有扩增），说明样品制备操作无效或有污 染，实验结果无效，需要重复样品制备过程或请跟厂家联系。