牛肾盂肾炎棒杆菌染料法荧光定量PCR试剂盒

牛肾盂肾炎棒杆菌染料法荧光定量PCR试剂盒

英文名称：Corynebacterium renale

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品介绍

产品及特点

肾棒状杆菌(Corynebacterium Renale)革兰氏染色阳性，为球杆状或棍棒 状，呈单在、成丛或栅栏样排列。细菌性肾盂肾炎由肾棒状杆菌引起，主要发生 于母牛，公牛少见，马和绵羊偶可发生。本病为尿源性感染，因此病原菌经尿道 生殖道口感染后，先引起尿道炎、膀胱炎或子宫内膜炎，然后再逆行导致肾盂肾 炎。由于肾组织损伤与尿液滞留，最终病畜可因尿毒症而死亡。病牛主要表现发 热，食欲不振，尿频，尿少，尿因混有黏液、脓液、大量蛋白质、脓细胞和白细 胞、脱落的上皮细胞等而浑浊带血色。尿液涂片或细菌培养可发现病原菌。严重 病例常发生尿毒症。本产品就是以染料法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门 检测牛肾盂肾炎棒杆菌的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。

2. 特异性高，引物是根据牛肾盂肾炎棒杆菌高度保守区设计,不会扩增其他细 菌。

3. 引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规 PCR 高 100 倍。

4. 提供无传染性的 PCR 阳性对照，便于区分假阴性样品。

5. 一管式操作，荧光 PCR 检测，不容易产生环境污染。

6. 本产品只能用于科研，本试剂盒足够 50 次 20μL 体系的 PCR。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

自备试剂 样品 DNA。

使用方法 一、制备标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。 由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头， 下同）。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 阳性对照（其浓度为 1×10E8 拷贝/μL，试剂盒提 供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7. 用自选方法纯化样品的 DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。

8. 如果有 N 个样品，则需要进行 N+2 个样品提取，多出的一个用作样品制备 阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。本试剂盒免费赠送 20 次免 DNA 提取的核酸释放剂试用装，该释放剂的裂解液可以直接作为 PCR 模板，省略了 DNA 提取步骤。

三、设置 qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9. 如果进行定量分析，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线样品。如果做定 性分析，则 6 个标准曲线样品只选一个做（可以选 4 号，其余样品不变）。 以下只介绍定量分析的反应设置。

10. 在标记管中按下表加入各成分：

成分 N+2 个 样品管 PCR 阴性 对照管 标准曲线 样品管（2-7 管） 2×qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL 牛肾盂肾炎棒杆菌染料法 qPCR 引物混合液 2 μL 2 μL 各 2 μL 自备 10×ROX (见注) 2 μL 2 μL 各 2 μL N+2 个待测样品 DNA 模板 6 μL - - 自备超纯水 - 6 μL - 第 7 步所得标准曲线样品稀释液 （2-7 号） - - 各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…）

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、 RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，则用水替代。

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同 而自行优化）。

四、荧光定量 PCR 反应参数

过程 温度 时间 预热 50℃ 2 min 预变性 95℃ 10 min PCR 反应 （40 个循环） 95℃ 15 sec 60℃ 1 min（采集 SYBR 通道的荧 光信号） 按仪器预设程序进行熔解曲线分析

五、数据处理

12. 设定 60℃-96℃范围的熔解曲线分析，排除假阳性。

13. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

14. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小 于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。