新生隐球菌PCR试剂盒

新生隐球菌PCR试剂盒

英文名称：Cryptococcus neoformans

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产品介绍：

产品及特点

新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)是深部感染真菌中隐球菌属的主 要菌种之一，种类较多，广泛分布于自然界，例如受动物污染的土壤，检出率较 高。由于肿瘤及化疗药物的使用、艾滋病的流行、移植术后免疫抑制药物的使用 等原因，新生隐球菌的发病率越来越高，在国外已成为艾滋病患者常见的并发症 之一，也是导致患者死亡的重要原因，在我国新生隐球菌的发病率也呈逐年增加 的趋势，因此快速检测新生隐球菌具有重要意义。荧光定量 PCR 是检测传染性 疾病的主流技术，本产品就是以染料法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检 测新生隐球菌的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。

2. 特异性高，引物是根据新生隐球菌高度保守区设计,不会扩增其他微生物。

3. 引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规 PCR 高 100 倍。

4. 提供无传染性的 PCR 阳性对照，便于区分假阴性样品。

5. 一管式操作，荧光 PCR 检测，不容易产生环境污染。

6. 本产品只能用于科研，本试剂盒足够 50 次 20uL 体系的荧光定量 PCR。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

自备试剂 样品 DNA。

使用方法

一、制备标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。 由于标准品浓度非常高，因此下列稀 供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7. 用自选方法纯化样品的 DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。

8. 如果有 N 个样品，则需要进行 N+2 个样品提取，多出的一个用作样品制备 阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。如果需要使用本试剂盒自带 的免 DNA 提取核酸释放剂试用装，

三、设置 qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9. 如果做定量检测，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线样品。如果做定性检 测，则 6 个标准曲线样品只做其中 1 个（比如选择第 4 号），样品数为 N+4。

10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后最后加）： 成分 N+2 个 样品管 PCR 阴性 对照管 标准曲线 样品管（2-7 管） 2×qPCR MagicMix （棕色管） 10 μL 10 μL 各 10 μL 新生隐球菌 PCR 引物 混合液（白盖） 2 μL 2 μL 各 2 μL 自备 10×ROX (见注) 2 μL 2 μL 各 2 μL 待测样品 DNA 模板 6 μL 不加 不加 第 7 步所得标准曲线样 品稀释液（2-7 号） 不加 不加 各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…）

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、 RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，则用水替代。

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同 而自行优化）。

四、荧光定量 PCR 反应参数

过程 温度 时间 预变性 94℃ 10 min PCR 反应 （40 个循环） 94℃ 15 sec 58℃ 60 sec（采集 SYBR 通道的荧 光信号） 最后延伸 72℃ 10 min

五、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值 为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小 于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。