李斯特菌通用染料法荧光定量PCR试剂盒

李斯特菌通用染料法荧光定量PCR试剂盒

英文名称：Listeria spp.

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品介绍

产品及特点

 李斯特菌(Listeria spp.)是一种兼性厌氧细菌，为李斯特菌症的病原体。李斯特菌是革兰氏阳性菌，属厚壁菌门，取名自约瑟夫•李斯特。它主要以食物为传染媒介，是最致命的食源性病原体之一，感染后健康成人可出现轻微类似流感症状，易感者突然发热，剧烈头痛、恶心、呕吐、腹泻、败血症、脑膜炎、孕妇出现流产，给人体健康带来较大的损害，因此李斯特菌的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。荧光定量PCR是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以染料法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测李斯特菌通用的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供DNA模板。

2. 特异性高，引物是根据人单核细胞增生李斯特菌高度保守区设计,不会扩增其他细菌。

3. 引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规PCR高100倍。

4. 提供无传染性的PCR阳性对照，便于区分假阴性样品。

5. 一管式操作，荧光PCR检测，不容易产生环境污染。

6. 本产品只能用于科研，本试剂盒足够50次20μL体系的PCR。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂 样品DNA。

使用方法 一、制备标准曲线样品（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3. 在7号管中加入5 μL 阳性对照（其浓度为1×10E8拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7. 用自选方法纯化样品的DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。

8. 如果有N个样品，则需要进行N+2个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。本试剂盒免费赠送20次免DNA提取的核酸释放剂试用装，该释放剂的裂解液可以直接作为PCR模板，省略了DNA提取步骤。

三、设置qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

9. 如果进行定量分析，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。如果做定性分析，则6个标准曲线样品只选一个做（可以选4号，其余样品不变）。以下只介绍定量分析的反应设置。

10. 在标记管中按下表加入各成分：

成分 N+2个

样品管 PCR阴性对照管 标准曲线

样品管（2-7管）

2×qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各10 μL

单核细胞增生李斯特菌 PCR引物混合液 2 μL 2 μL 各2 μL

自备10×ROX (见注) 2 μL 2 μL 各2 μL

 N+2个待测样品DNA模板 6 μL 不加 不加

自备超纯水 不加 6 μL 不加

第7步所得标准曲线样品稀释液（2-7号） 不加 不加 各6μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）

注:仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX，则用水替代。

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR（具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化）。

四、荧光定量PCR反应参数

过程 温度 时间

预变性 94℃ 5 min

PCR反应

（40个循环） 94℃ 0.5 min

50℃ 0.5 min（采集SYBR通道的荧光信号）

72℃ 0.5 min

最后延伸 72℃ 10 min

五、数据处理

12. 设定60℃-96℃范围的融解曲线分析，排除假阳性。

13. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

14. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。