单核细胞增生李斯特菌探针法荧光定量PCR试剂盒

单核细胞增生李斯特菌探针法荧光定量PCR试剂盒

英文名称：Listeria monocytogenes

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品介绍：

产品及特点

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)属乳酸杆菌科，为革兰氏阳性小杆菌，可以污染食品，导致李斯特病的发病率日趋上升，临床表现主要有脑膜炎、败血性肉芽肿、淋巴结肿大等。本病遍及世界各地，是人畜共患的传染病。人类感染有增多趋势，特别是新生儿、老年人、孕妇及免疫功能低下者易感性更高。对食品中的单增利斯特菌做出快速的检测和鉴定，是预防利斯特病的有效方法，因此单核细胞增生李斯特菌的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。荧光定量PCR是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以染料法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测单核细胞增生李斯特菌的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。

2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 特异性高，引物是根据锦鲤疱疹病毒 Sph 基因高度保守区设计，不会跟其 他病毒的 DNA 发生交叉反应。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。

6. 本产品只能用于科研。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

自备试剂 样品 DNA。

使用方法 一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。 由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头， 下同）。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7. 如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼 容。也可以选购本公司的柱式病毒DNAout。本试剂盒免费赠送 20次免DNA 提取的核酸释放剂，本产品的裂解液可以直接作为 PCR 模板，省略 了 DNA 提取步骤。

三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用 水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模 板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后最后加）：

成分 样品管N+2 个 PCR 阴性 对照管 标准曲线 样品管（2-7 管）

2×Probe qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL

锦鲤疱疹病毒 Sph 基因 qPCR 探 针 1 μL 1 μL 各 2 μL

锦鲤疱疹病毒 Sph 基因探针法 qPCR 引物混合液 2 μL 2 μL 各 2 μL

N+2 个待测 DNA 模板 6 μL 不加 不加

超纯水 不加 6 μL 不加

第 7 步所得标准曲线样品稀释液 （2-7 号） 不加 不加 各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…）

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

过程 温度 时间

预变性 95℃ 10 min

PCR 反应 （40 个循环） 95℃ 15 sec 52℃ 30 sec 72℃ 30 sec（采集 FAM 通道的荧光 信号）

四、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小 于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。