脊髓灰质炎病毒通用型染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

脊髓灰质炎病毒通用型染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

英文名称：Poliovirus(PV)

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他：

产品介绍：

产品及特点

脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV）是引起脊髓灰质炎的病毒，该疾病传 播广泛，是一种急性传染病。病毒常侵犯中枢神经系统，损害脊髓前角运动神 经细胞，导致肢体松弛性麻痹，多见于儿童，故又名小儿麻痹症。脊髓灰质炎 是 WHO 推行计划免疫进行控制的重点传染病。因此灵敏快捷的诊断产品具有 重要的意义。本产品基于 PCR 原理开发。它具有下列特点：

1. 一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。

2. 根据脊髓灰质炎病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。

3. 基于染料法 qRT-PCR 检测，灵敏度比常规 RT-PCR 高 10-100 倍，可以 达到至少 1000 拷贝/反应。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技术，RT 和 PCR 两步在一个试管内完成，不需要 中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的 RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。阳性对照需要单独放置。

自备试剂 样品 RNA

使用方法 一、稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓 度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行）。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入 45 μ L 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

2. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供)，充 分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

3. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释 所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

4. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释 所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备

5. 若有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的阳性对 照梯度稀释液中的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万 拷贝）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一 样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可用水作为制备的阴性对照。

6. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 20 次免 RNA 提取的核酸释放 剂试用装

。 三、设置 RT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

7. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对 照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释 液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

8. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照 设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖后加）：

成分 N+2 个制备 所得样品 RT-PCR 阴性对照 RT-PCR 阳性 对照（2-7 管）

2×qRT-PCR 缓冲液 10μL 10μL 各 10μL

脊髓灰质炎病毒通用型染料法 qRT-PCR 引物混合液 2μL 2μL 各 2μL

50×ROX (见注) 0.4μL 0.4μL 各 0.4μL

N+2 个 RNA 模板 5.6μL 不加 不加

6 个阳性对照稀释液 不加 不加 各 5.6μL（2 号样 到 2 号管，3 号样 到 3 号管…）

10×qRT-PCR 酶混合液 2μL 2μL 2μL

注:需使用 ROX 染料 I 的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、 Step-One、Step-One Plus。 需使用 ROX 染料 II 的机型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research 的 Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。 不需要使用 ROX 的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System， LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene 3000、RotorGene 6000。

9. 上机后按下面参数进行 RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。

过程 温度 时间 RT（

逆转录） 50℃ 15-30 分钟

预变性 94℃ 2 分钟

RT - PCR 反应 （40 个循环） 95℃ 15 秒 60℃ 15 秒（采集 FAM 通道的荧光信号） 72℃ 15 秒

按仪器预设程序进行熔解曲线分析

四、数据处理

10. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

11. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应 该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如 果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验 的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。