韦塞尔斯布朗病毒探针法荧光定量PCR试剂盒

韦塞尔斯布朗病毒探针法荧光定量PCR试剂盒

英文名称：Wesselsbron Virus

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品介绍：

产品及特点

韦塞尔斯布朗病毒（Wesselsbron Virus、SV）引起韦塞尔斯布朗病（Wesselsbron disease、WSL），它是一种经蚊虫传播的虫媒人畜共患传染病毒，主要感染羊和其他一些反刍动物，可引起绵羊和山羊的流产及羔羊死亡，也会感染人。随着我国与非洲国家交往的不断加强，国际贸易范围不断扩大，韦塞尔斯布朗病传入我国的风险不断加大，我国已明确将其列八从非洲进口反刍动物议定书的检疫要求中，掌握该病的流行状况、开展相应的诊断检测技术研究以及制订相关技术标准不仅十分必要而且迫在眉睫。本产品就是为此目的根据 PCR原理开发的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。

2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 特异性高，引物是根据人韦塞尔斯布朗病毒高度保守区设计，不会跟其他病毒的 DNA 发生交叉反应。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。

6. 本产品只能用于科研。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂 样品DNA。

使用方法 一、稀释标准曲线样品（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7. 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。

8. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数细菌DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的细菌DNAout或柱式细菌DNAout。本试剂盒免费赠送20次免DNA提取的核酸释放剂，本产品的裂解液可以直接作为PCR模板，省略了DNA提取步骤。

三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分 样品管

N+2个 PCR阴性对照管 标准曲线

样品管（2-7管）

2×Probe qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各10 μL

副溶血性弧菌qPCR探针 2 μL 2 μL 各2 μL

副溶血性弧菌探针法qPCR引物混合液 2 μL 2 μL 各2 μL

 N+2个待测DNA模板 6 μL 不加 不加

超纯水 不加 6 μL 不加

第7步所得标准曲线样品稀释液（2-7号） 不加 不加 各6μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：

过程 温度 时间

预变性 94℃ 5 min

PCR反应

（40个循环） 94℃ 0.5 min

55℃ 0.5 min（采集FAM通道的荧光信号）

72℃ 0.5 min

最后延伸 72℃ 10 min

五、数据处理

12. 以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

六、电泳检测

13. 如果有必要电泳确认，可取10-20 uL PCR产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产物的大小为400 bp。但电泳非常容易污染实验环境，建议不轻易采纳。