禽偏肺病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

禽偏肺病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

英文名称：Avian Metapneumovirus(aMPV)

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品介绍：

产品及特点

禽偏肺病毒(Avian Metapneumovirus，aMPV)会引起禽类的呼吸道感染，该病传播迅速，发病率高，死亡率不定（火鸡的死亡率可能较高）；出现打喷嚏、罗音、鼻窦炎、结膜炎、眼部有分泌物、鼻漏，以及蛋禽产蛋下降等临床症状，该病的发生会给养殖业造成较大的经济损失，因此灵敏快捷的诊断产品具有重要的意义。本产品基于PCR原理开发。它具有下列特点： 

1.一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。

2.根据禽偏肺病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。

3.基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。

4.使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。

本产品足够50次30μL体系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。阳性对照需要单独放置。 自备试剂 样品 RNA

使用方法 一、稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓

度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行）。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入 45 μ

L 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

2. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供)，充

分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

3. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释

所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

4. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释

所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备

5. 若有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性

对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的阳性

对照梯度稀释液中的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1

万拷贝）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品

一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可用水作为制备的阴性

对照。

6. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA

提取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 20 次免 RNA 提取的核酸释放

剂试用装，其使用手册可以从

三、设置 RT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

7. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个

用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6

个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个

PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对

照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释

液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

8. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照

设置完毕后才设置阳性对照，阳性对照样品要等所有管子盖上盖后加）：

成分

N+2 个制备

所得样品

RT-PCR

阴性对照

RT-PCR 阳性

对照（2-7 管）

2×qRT-PCR 缓冲液 10μL 10μL 各 10μL

禽白血病病毒通用染料法

qRT-PCR 引物混合液

2μL 2μL 各 2μL

50×ROX (见注) 0.4μL 0.4μL 各 0.4μL

N+2 个 RNA 模板 5.6μL 不加 不加

6 个阳性对照稀释液 不加 不加

各 5.6μL（2 号样

到 2 号管，3 号样

到 3 号管…）

10×qRT-PCR

酶混合液

2μL 2μL 2μL

注:需使用 ROX 染料 I 的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、

Step-One、Step-One Plus。

需使用 ROX 染料 II 的机型：：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research

的 Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。

不需要使用 ROX 的机型：Thermal Cycle Dice Real Time System，

LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene

3000、RotorGene 6000。

9. 上机后按下面参数进行 RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。

过程 温度 时间

RT（逆转录） 50℃ 15-30 分钟

预变性 94℃ 2 分钟

RT - PCR 反应

（40 个循环）

95℃ 15 秒

60℃ 15 秒（采集 FAM 通道的荧光信号）

72℃ 15 秒

按仪器预设程序进行熔解曲线分析

四、数据处理

10. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct

值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品

DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

11. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验

的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。