埃希氏菌通用染料法荧光定量PCR试剂盒

埃希氏菌通用染料法荧光定量PCR试剂盒

英文名称：Escherichia spp.

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品介绍

产品及特点

大肠埃希氏菌，俗称大肠杆菌（Escherichia coli），属于革兰氏阴性细菌。 大肠杆菌 O157:H7 是肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)的最常见类型，O 表示抗原类型, H7 表示血清型。其感染剂量极低， 人体只要摄入 10 个细菌就可以致病，目前还没有特效疫苗，因此大量开展预防 检测工作具有重要的意义。目前对 O157 的检测主要是传统分离培养、免疫学 和分子水平的 PCR 检测。本试剂盒就是利用实时荧光定量 PCR 技术开发的大 肠杆菌 O157:H7 检测试剂盒，它通过荧光染料实时显示样品模板 DNA 的量， 并通过坐标曲线表示出来，结果直观准确。它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品模板，操作简单，定量准确快速。

2. 荧光定量 PCR 检测，反应特异性强。

3. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限一年。

自备试剂 样品等

使用方法

一、样品 DNA 的制备 用自选方法提取细菌样品 DNA。注意：DNA 纯化方法是决定检测灵敏度的 关键因素。如果不能很好纯化样品 DNA，后面的 PCR 再灵敏也不能提高整体检 测灵敏度。

二、制备 O157:H7 标准曲线（（以 10-10E6 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标 准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样 品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品 不提供活体病毒做阳性对照，只提供没有传染性的、可以直接使用的 DNA 片段 作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 6，5，4，3，2 和 1 号。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 超纯水（最好用带芯枪头，下同）。

3. 先将本试剂盒提供的阳性对照用 TE 缓冲液或超纯水 10 倍梯度稀释到 10E7 拷贝/μL（注：请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至 10E7 拷贝/μL，建议每次稀释 10 倍，梯度稀释至 10E7 拷贝/μL）。

4. 在 6 号管中加入 5 μL 10E7 拷贝/μL 的 O157:H7 阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 10E6 拷贝/μL 的阳性对照。

5. 换枪头，从 6 号管中取 5 μL 溶液到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 10E5 拷贝/μL 的阳性对照。

6. 换枪头，从 5 号管中取 5 μL 溶液到 4 号管中，重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。

7. NC 管中不加任何阳性对照。

8. 从 1-6 号管中分别取 5 μL 和待测样品一起进行定量 PCR（见下步），每个 样品做 3 次重复。PCR 后得到每个阳性对照稀释样品的荧光 PCR Ct 值， 并以之为纵轴，以浓度的对数值为横轴，绘制标准曲线。

三、PCR 检测（20 μL 体系）

1. 在 PCR 管中加入下列成分（待测样品需要做三次重复，下表只列出一次）：

成分 样品 阴性对照 阳性对照 2×qPCR Mix 10 μL 10 μL 10 μL 待测样品 DNA 模板 1-5 μL 无 无 O157:H7 阳性对照 无 无 5 uL（每个 管加一个 稀释度的 对照） 自备 10×ROX (见注) 2 μL 2 μL 2 μL O157:H7 专一性引物对 2 μL 2 μL 2 μL 补水到 20 μL

注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、 RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX。

2. 建议 PCR 反应参数（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）

过程 温度 时间 预变性 95℃ 10 min PCR 反应 （40 个循环） 94℃ 15 s 60℃ 30 s

3. 数据采集

具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA 时，最大吸收光谱在 471 nm，结合 DNA 时的最大吸收光谱在 500 nm， 最大发射光谱在 530 nm。

四、数据处理

以 O157:H7 阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲 线。再以待测样品浓度的 log 为横轴，以 Ct 值为纵轴，通过待测样品的 Ct 值 计算出样品 DNA 的浓度。