血吸虫通用染料法荧光定量PCR试剂盒

血吸虫通用染料法荧光定量PCR试剂盒

英文名称：Schistosoma spp.

运输：低温

保存：负20度

有效期：一年

货期：2-3周

其他： 

产品介绍

产品及特点

血吸虫通用(Schistosoma spp.) 会引起血吸虫病，该病主要通过皮肤，黏膜与疫水接触受染。患病后，侵袭期患者可有咳嗽、胸痛、偶见痰中带血丝等症状，急性期临床上常会出现发热、痢疾样大便且带血和黏液、肝脾大、咳嗽、胸痛，血痰等症状，慢性期多因急性期未曾发现，未治疗或治疗不彻底，或多次少量重复感染等原因，逐渐发展而成，晚期病人极度消瘦，出现腹水、巨脾，腹壁静脉怒张等晚期严重症状。感染该病对人体健康造成严重损害，因此快速检测血吸虫通用具有重要意义。荧光定量PCR是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以染料法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测血吸虫通用的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供DNA模板。

2. 特异性高，引物是根据人血吸虫通用高度保守区设计,不会扩增其他细菌和微生物。

3. 引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规PCR高100倍。

4. 提供无传染性的PCR阳性对照，便于区分假阴性样品。

5. 一管式操作，荧光PCR检测，不容易产生环境污染。

6. 本产品只能用于科研，本试剂盒足够50次20μL体系的PCR。

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂 样品DNA。

使用方法 一、制备标准曲线样品（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1. 标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。

3. 在7号管中加入5 μL 阳性对照（其浓度为1×10E8拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7. 用自选方法纯化样品的DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。

8. 如果有N个样品，则需要进行N+2个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。如果用本试剂盒自带的DNA释放剂试用装。则按下面步骤操作：

9. 配制溶液A工作液。以配制1mL工作液（足够10个样品）为例：在一干净塑料管中加入10μL溶液A成分一，20μL溶液A成分二和970μL超纯水，充分混合均匀即可。溶液A工作液可室温放置，但最好在一周内用完，不要长期放置。一次检测一个样品需要100μL溶液A工作液，1mL工作液足够10个样品。如果待测样品数量为其他数字，配制的溶液A工作液的体积需要做相应的调整。

10. 在标记好的N+2个离心管中，加入1-5mg（半粒芝麻大小）固体待测样品或5μL液体待测样品。在样品制备阳性对照中加入5μL阳性对照，在样品制备阴性对照中加入5μL水。

11. 在每个管中加入100 μL溶液A工作液，确保固体样品被溶液淹埋，如果是液体样品则震荡混匀。

12. 95℃保温10分钟。

13. 待冷却到常温后加入10μL溶液B并混匀得DNA释放液。每个样品得到的DNA释放液足够进行50-100次PCR。

三、设置qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

14. 如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。

15. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分 样品管

N+2个 PCR阴性对照管 标准曲线

样品管（2-7管）

2×qPCR MagicMix

（棕色管） 10 μL 10 μL 各10 μL

血吸虫通用 PCR引物混合液（白盖） 2 μL 2 μL 各2 μL

自备10×ROX (见注) 2 μL 2 μL 各2 μL

 待测样品DNA模板 6 μL 不加 不加

第7步所得标准曲线样品稀释液（2-7号） 不加 不加 各6μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）

注:仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX，则用水替代。

16. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR（具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化）。

四、荧光定量PCR反应参数

过程 温度 时间

预变性 94℃ 5 min

PCR反应

（35个循环） 94℃ 0.5 min

50℃ 0.5 min（采集SYBR通道的荧光信号）

72℃ 0.5 min

最后延伸 72℃ 10 min

五、数据处理

17. 设定60℃-96℃范围的融解曲线分析，排除假阳性。

18. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

19. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。

五、电泳检测

20. 如果有必要电泳确认，可取10-20 μL PCR产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产物的大小为400 bp。